酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是一種廣泛應(yīng)用的生物分析技術(shù)，用于定量或定性檢測樣品中的特定蛋白質(zhì)、抗體或其他分子。針對γ干擾素（IFN-γ）這一重要的細(xì)胞因子，其專用的γ干擾素ELISA檢測試劑盒通過高度特異且靈敏的方法實現(xiàn)精準(zhǔn)測量。以下是該實驗的具體原理及步驟解析：

　　γ干擾素ELISA檢測試劑盒核心機制：抗原-抗體特異性結(jié)合與信號放大

　　1. 固相載體包被捕獲抗體

　　微孔板的每個孔內(nèi)預(yù)先涂布了抗人/小鼠/大鼠等物種來源的IFN-γ單克隆抗體（簡稱“捕獲抗體”）。這些抗體能夠特異性識別并結(jié)合樣本中的IFN-γ分子，形成穩(wěn)定的固相復(fù)合物。未結(jié)合的成分會在后續(xù)洗滌步驟中被去除，從而分離目標(biāo)蛋白與其他雜質(zhì)。

　　2. 封閉多余位點減少非特異性吸附

　　為防止非目標(biāo)物質(zhì)黏附于塑料表面導(dǎo)致假陽性結(jié)果，需加入牛血清白蛋白（BSA）或其他惰性蛋白溶液進行封閉處理。此舉可有效阻斷無關(guān)成分與板壁的結(jié)合，提高檢測特異性。

　　3. 標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣的平行競爭反應(yīng)

　　將已知濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋后的待測樣本分別加入到已包被抗體的反應(yīng)孔中。此時，溶液中的游離IFN-γ會與固定化的捕獲抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成“夾心”結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)層。此階段的溫度控制至關(guān)重要，通常在室溫下孵育以保證最佳結(jié)合效率。

　　4. γ干擾素ELISA檢測試劑盒檢測抗體標(biāo)記物引入二次識別

　　隨后添加另一種針對IFN-γ不同表位的酶標(biāo)多克隆抗體（即“檢測抗體”），它能同時連接已固定的抗原和支持下一步顯色反應(yīng)。常用的標(biāo)記酶包括辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP），它們能催化底物產(chǎn)生可觀測的顏色變化。

　　5. 底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生可視化信號

　　當(dāng)所有未結(jié)合的物質(zhì)再次被洗去后，向體系中加入相應(yīng)的酶促反應(yīng)底物。例如，若使用HRP作為標(biāo)記酶，則選用四甲基聯(lián)苯胺（TMB）；若是AP，則采用對硝基苯酚磷酸酯（pNPP）。在酶的作用下，無色的底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物，其強度與原始樣本中的IFN-γ含量成正比。

　　6. 終止液定格終態(tài)便于比色讀數(shù)

　　為停止酶促反應(yīng)并穩(wěn)定顯色效果，最后加入硫酸等強酸溶液作為終止劑。此時各孔呈現(xiàn)穩(wěn)定的顏色深度，可通過酶標(biāo)儀在特定波長下測定吸光度值（OD值），進而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算未知樣本的濃度。