轉(zhuǎn)基因植物NOS 終止子核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

通用名稱(chēng)：轉(zhuǎn)基因植物 NOS 終止子核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法) 

Name ：tNOS Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

根農(nóng)桿菌煙脂堿合成酶基因終止子（tNOS）是轉(zhuǎn)基因作物常用到的元件之一，   到目前為止，43%的轉(zhuǎn)基因作物含有 NOS 終止子。熒光 PCR 技術(shù)因其靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。

本試劑盒適用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的 NOS 終止子基因，用于篩查待檢測(cè)植物中是否含有 NOS 成分。。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒根據(jù) NOS 終止子序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。

【試劑組成】

注：

1）  不同批號(hào)試劑不能混用。

2）  試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

稱(chēng)取 200g 樣品。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 0℃冰壺。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

固體樣本：用粉碎機(jī)或冷凍研磨儀將樣品研磨至細(xì)粉狀。

1.2  DNA 提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取

法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.  試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿(mǎn) 10 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；熒光通道選擇： 檢測(cè)通道

（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線(xiàn)出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線(xiàn)至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線(xiàn)有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線(xiàn)；

可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值

≤38，且曲線(xiàn)有明顯的增長(zhǎng)曲線(xiàn)，判定為陽(yáng)性，否則為陰性； 陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。

6.  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7.  檢測(cè)方法的局限性

? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

? 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

? 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或   定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

? 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

? 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全   通則》進(jìn)行處理。.

【參考文獻(xiàn)】

[1]  中國(guó)農(nóng)業(yè)部. 1782 號(hào)公告-3-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)調(diào)控元件CamV 35S 啟動(dòng)子、FMV 35S 啟動(dòng)子、NOS 啟動(dòng)子、NOS 終止子和 CaMV 35S 終止子定性 PCR 方法[S]. 北京: 科學(xué)出版社, 2012.

[2] 徐俊鋒, 王鵬飛, 李玥瑩, 等. 轉(zhuǎn)基因植物中CaMV35S 和tNOS 元件的 4 種定性PCR 檢測(cè)方法的比較. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2015 , 23 (3) :397-407.

[3] 周建嫦, 楊明杰, 楊杏芬. PCR 法檢測(cè)食品和動(dòng)物飼料中的轉(zhuǎn)基因成分[J]. 衛(wèi)生研究, 2005 , 34 (6) :732-735.