氨基酸(amino acid, AA)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                              微量法 100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

動(dòng)物肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官，故尿中氨基酸的變化最能反應(yīng)肝、腎的生理狀態(tài)。另外，氨基酸還能反應(yīng)灼傷、傷寒等方面情況。植物體內(nèi)氨基酸含量對(duì)研究植物在不同條件下及不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期氮代謝變化、植物對(duì)氮素的吸收、運(yùn)輸、同化及營(yíng)養(yǎng)狀況等有重要意義。

測(cè)定原理：

氨基酸的α -氨基可與水合茚三酮反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)紫色化合物，在570 nm有特征吸收峰；通過(guò)測(cè)定570 nm吸光度，來(lái)計(jì)算氨基酸含量。

自備儀器及用品：

臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、無(wú)水乙醇、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃避光保存。臨用前加入667μL無(wú)水乙醇，蓋緊后充分混勻，再加入9.333 mL蒸餾水混勻，避光保存。

試劑四：粉劑×1管，4℃避光保存。臨用前加1 mL蒸餾水，充分溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1瓶，臨用前加10 mL蒸餾水，充分溶解。1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，4℃避光保存。

樣品中AA提取：

1.        按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行室溫勻漿，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來(lái)水冷卻后，8000g，，4℃離心10min，上清液置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3.        血清等液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到570 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取EP管，加入10μL蒸餾水，100μL試劑二，100μL試劑三和10μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次，于570nm測(cè)定吸光值，記為A空白管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測(cè)完。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管，加入10μL標(biāo)準(zhǔn)品，100μL試劑二，100μL試劑三和10μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋

（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次，于570nm測(cè)定吸光值，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測(cè)完。

4. 測(cè)定管：取EP管，加入10μL上清液，100μL試劑二，100μL試劑三和10μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次，于570nm測(cè)定吸光值，記為A測(cè)定管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測(cè)完。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。

氨基酸含量計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

氨基酸含量（μmol /mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)]÷（V樣×Cpr）

=1×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白) ÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)] ÷（V樣總÷V樣）÷W

=1×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白) ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細(xì)胞數(shù)量）

=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷V樣

=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.01 mL；W：樣品質(zhì)量，g；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.01 mL；V樣總：樣品提取液總體積，1mL；；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)] ÷（V樣×Cpr）

=1×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白) ÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白)]×（V樣總÷V樣）÷W

=1×(A測(cè)定－A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)－A空白) ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細(xì)胞數(shù)量）

=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷V樣

=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.01 mL；W：樣品質(zhì)量，g；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.01mL；V樣總：樣品提取液總體積，1mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

注意事項(xiàng)：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標(biāo)準(zhǔn)品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天內(nèi)使用完畢。

2. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過(guò)高（高于2.5），用蒸餾水稀釋后再測(cè)定。

3. 脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)在570nm處無(wú)吸收峰，因此，570nm處測(cè)定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。

4．最di檢出限為100μmol/L。