乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)試劑盒說明書

                                          微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ACC在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

測(cè)定原理：

ACC能夠催化乙酰輔酶A、NaHCO₃和ATP生成丙二酰輔酶A、ATP和無機(jī)磷，通過鉬酸銨定磷法測(cè)定無機(jī)磷的增加量來測(cè)定ACC活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：10mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑五：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑六：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑七：10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   酶促反應(yīng)試劑的配制和預(yù)熱：在試劑二瓶中加入2.5mL試劑一，充分溶解混勻；在試劑三瓶中加入2mL蒸餾水，充分溶解混勻；將試劑一、二、三在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘。

3、定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑

              應(yīng)為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

4、0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑七20倍稀釋，即取 0.5mL試劑七加9.5蒸餾水，充分混勻。

5、酶促反應(yīng)

37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，90℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清

6、定磷

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）保溫30min，冷卻至室溫，在 660nm處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值A。標(biāo)準(zhǔn)管、空白管只要做一次即可，每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

注意：若測(cè)定管吸光值大于2，將樣品用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進(jìn)行測(cè)定，使吸光值小于2，可提高檢測(cè)靈敏度，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

ACC活性計(jì)算：

1、按組織蛋白濃度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC活力單位。

ACC (μmol/h/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷

(V樣×Cpr)÷T=10×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算：

定義：每小時(shí)每g組織產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC活力單位。

ACC (μmol/h /g鮮重)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷

(W× V樣÷V樣總)÷T=10×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

3、   按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每500萬細(xì)菌或細(xì)胞產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC活力單位。

ACC (U/10⁴ cell)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×V總÷

(500× V樣÷V樣總)÷T=0.02×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.1mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。