細胞壁不溶性酸性轉化酶（cell-wall binding acid invertase, B-AI）試劑盒說明書

                                          微量法100管/48樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

蔗糖轉化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關鍵酶之一。根據最適 pH，Ivr分為酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI）兩種類型。                           

AI的最適pH為3～5。AI分為可溶性AI(S-AI)和細胞壁不溶性AI（B-AI）兩種類型。B-AI存在于細胞間隙并結合在細胞壁上，主要參與韌皮部質外體卸載時蔗糖的分解，以維持庫源之間蔗糖的濃度。

測定原理：

B-AI催化蔗糖降解產生還原糖，進一步與3,5－二硝基水楊酸反應，生成棕紅色氨基化合物，在510nm有特征光吸收，在一定范圍內510nm光吸收增加速率與B-AI活性成正比。

自備用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液1：液體100mL×1瓶，4℃保存;

提取液2：液體100mL×1瓶，4℃保存;

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存;

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入10mL試劑一充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存;

試劑三：液體15mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：提取液1體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液1），進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心10min，棄上清，沉淀中加入1mL蒸餾水，充分震蕩混勻，12000g 4℃離心10min，棄上清，沉淀中加入1mL提取液2 充分混勻，4℃浸提過夜，12000g 4℃離心20min，取上清置冰上待測。

測定步驟和加樣表：

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至510nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻， 37℃準確水浴30min后，95℃水浴10min（蓋緊，以防水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

混勻，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中， 510nm處記錄各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸餾水稀釋后測定(計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù))，ΔA=A測定-A對照。每個測定管設一個對照管。

B-AI活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。

（1）按蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI活性（μg /min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI活性（μg /min /g鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，30min； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。

（1）按蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI活性（μg /min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。

B-AI活性（μg /min /g鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，30min； Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。