谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                               微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

GSH-Px是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與ROS反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，從而保護(hù)生物膜免受ROS的損害，維持細(xì)胞的正常功能；而且具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮抗有害金屬離子對(duì)機(jī)體的傷害和增加機(jī)體抗輻射等能力。

測(cè)定原理：

GSH-Px催化有機(jī)過(guò)氧化物氧化GSH，產(chǎn)生GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH還原GSSG，再生GSH，同時(shí)NADPH氧化生成NADP⁺；NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP⁺沒(méi)有；通過(guò)測(cè)定340 nm光吸收減少速率來(lái)計(jì)算GSH-Px活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、酶標(biāo)儀、96孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體120mL×1瓶，室溫保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體10μL×1支，-20℃保存。

試劑四：液體200μL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體：直接測(cè)定。

GSH-Px測(cè)定操作：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm。

2. 混合試劑在25℃或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱30min。

3. 混合試劑配制：臨用前，在試劑二中加入試劑一20 mL，充分震蕩溶解后加入全部試劑三，混勻。（當(dāng)天用完）

4. 試劑四的稀釋?zhuān)?/span>吸取21.5μL試劑四，加入5mL蒸餾水充分混勻，臨用前配制，配制好的試劑當(dāng)天使用。

5. 測(cè)定管：依次在96孔板中加入20μL上清液、160μL預(yù)熱的混合試劑、20μL稀釋后的試劑四，迅速混勻后于340nm處測(cè)定第30 s和第210s的吸光值，分別記為A1和A2。△A測(cè)定管= A1﹣A2。

GSH-Px活性計(jì)算：

使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

GSH-Px活力單位定義：一定溫度中，每mg蛋白每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（Cpr×V樣）÷T

=1072×△A÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

GSH-Px活力單位定義：一定溫度中，每g樣本每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/g 鮮重)=[△A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1072×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：一定溫度中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/10⁴ cell)= [△A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1072×△A÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：一定溫度中，每毫升液體每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個(gè)酶活單位。

GSH-Px (nmol/min/mL)=[△A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷V樣÷T

=1072×△A

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4 L；10⁶：1 mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL =2×10^-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min。

注意事項(xiàng)：

（1）樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力；

（2）混合試劑和底物液須臨用前配制，配完后置于冰上，當(dāng)天使用完；

（3）測(cè)定過(guò)程操作須迅速；

（4）細(xì)胞中GSH-Px活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中GSH-Px的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。