脫氫酶（dehydrogenase, DHA）試劑盒說明書

微量法100管/96樣

注   意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類催化物質(zhì)氧化還原反應的酶，催化底物通過細胞色素系統(tǒng)被氧化，釋放的能量供機體使用，是生物體取得能量的一種方式。

測定原理：

在細胞呼吸過程中，氫受體2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF呈現(xiàn)紅色，于485nm測定其吸光值，即得脫氫酶活性。

自備實驗儀器及用品：

篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請用戶自備）。

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存

試劑一：粉劑×1瓶，使用前加10mL試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）。

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：甲醇，自備。

樣品處理：

1.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

2.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min。

3.        液體：直接檢測。

測定步驟和操作表：

脫氫酶活力計算：

a.        用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.0422x - 0.0312；R² = 0.9988；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷W

3. 按液體體積計算

酶活單位定義：在37℃時，每mL樣本每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷V樣÷T= 0.181×（△A+0.0312）

V反總：反應總體積，1.1mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.1mL；T：培養(yǎng)時間，1d=1440min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL。

b. 用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.0211x - 0.0312；R² = 0.9988；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計算

酶活單位定義：在37℃時，每mg蛋白樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：在37℃時，每克樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.362×（△A+0.0312）÷W

3. 按液體體積計算

酶活單位定義：在37℃時，每mL樣本每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個酶活性單位。

DHA（μg/ min /mL）=（△A+0.0312）÷ 0.0211×V反總÷V樣÷T= 0.362×（△A+0.0312）

V反總：反應總體積，1.1mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.1mL；T：培養(yǎng)時間，1d=1440min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL。

注意事項：

配制好的試劑一避光保存于4℃，最好在一周內(nèi)使用，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。