己糖激酶(hexokinase，HK)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                          微量法 100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

HK（EC 2.7.1.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是葡萄糖分解過(guò)程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點(diǎn)。

測(cè)定原理：

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體20mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

（1）在試劑二中加入18mL試劑一充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在試劑三中加入1mL試劑一，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

注意：不同勻漿組織中HK活力不一樣，做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做1-2只預(yù)試，若ΔA>0.5，則說(shuō)明組織活力太

高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮短反應(yīng)時(shí)間至2min,使ΔA<0.5，以提高檢測(cè)靈敏度。

HK活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）HK活性

單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=643×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中HK活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）HK活性

單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1286×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中HK活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。