磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

PEPCK（EC 4.1.1.32）廣泛存在于動物、植物、微生物和細胞中，催化草酰乙酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸，是調節(jié)糖異生途徑的關鍵酶。

測定原理：

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體18 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：液體16.5uL×1支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1支， -20℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

3、試劑四的配制：臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

4、將工作液和試劑四置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱5分鐘。

5、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.1，需將樣本用提取液稀釋適當倍數后測定，使ΔA小于0.1可提高檢測

靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數。

PEPCK活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）PEPCK活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=3215×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PEPCK活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）PEPCK活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PEPCK活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPCK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=12.86×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。