維生素E（Vitamin E，VE）試劑盒說(shuō)明書

  微量法100T/48S

測(cè)定意義：

維生素E（Vitamin E）是一種脂溶性維生素，其水解產(chǎn)物為生育酚，是生物體中最主要的抗氧化劑之一，能阻止不飽和脂肪酸收到過(guò)氧化作用的損傷，維持不飽和脂肪酸細(xì)胞膜的完整性和正常功能，具有延緩衰老、預(yù)防溶血性貧血作用，在醫(yī)藥、化妝品、保健品、食品行業(yè)具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

測(cè)定原理：

VE還原Fe³⁺為Fe²⁺，Fe²⁺與1,10-菲羅啉產(chǎn)生有色絡(luò)合物，在530nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、漩渦震蕩儀。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體2mL×1支，4℃保存。

試劑三：液體2mL×1支，4℃保存。

試劑四：液體6mL×1瓶，4℃保存。

樣本處理：

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，勻漿后用提取液定至1mL，定至在漩渦混勻儀上震蕩5min，于25℃，5000g離心10min，取上層測(cè)定。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）后在漩渦混勻儀上震蕩5min，于25℃，5000g離心10min，取上層測(cè)定。

3.        血清：取0.1mL，加0.9mL提取液，漩渦儀混勻上震蕩5min，于25℃，5000g離心10min，取上層測(cè)定。                  

測(cè)定操作：

計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.22x + 0.0065 R² = 0.9978

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VE含量（μg/mg prot）=（△A -0.0065）÷ 0.22×V反總÷（V樣×Cpr）

                    = 9.09×（△A -0.0065）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VE含量（μg/g）= （△A -0.0065）÷ 0.22×V反總÷（V樣×W÷V樣總）

                    = 9.09×（△A -0.0065）÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VE含量（μg/10⁴ cell）=（△A -0.0065）÷ 0.22×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）

                    = 9.09×（△A -0.0065）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VE含量（μg/mL）=（△A -0.0065）÷ 0.22×V反總÷V樣×10

                = 90.9×（△A -0.0065）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

b.       用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.11x + 0.0065 R² = 0.9978

1. 按照蛋白含量計(jì)算

VE含量（μg/mg prot）=（△A -0.0065）÷ 0.11×V反總÷（V樣×Cpr）

                    = 18.18×（△A -0.0065）÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

VE含量（μg/g）= （△A -0.0065）÷0.11×V反總÷（V樣×W÷V樣總）

                    = 18.18×（△A -0.0065）÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

VE含量（μg/10⁴ cell）=（△A -0.0065）÷ 0.11×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）

                    = 18.18×（△A -0.0065）÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

VE含量（μg/mL）=（△A -0.0065）÷0.11×V反總÷V樣×10

                = 181.8×（△A -0.0065）

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

若反應(yīng)體系產(chǎn)生沉淀，需要將樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，并在?jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。