霍亂弧菌O1(VC O1)核酸檢測試劑盒熒光PCR法

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：霍亂弧菌O1(VC O1)核酸檢測試劑盒熒光PCR法

Name：Fluorescent PCR method of Vibrio cholerae O1 (VC O1) nucleic acid detection kit

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測氣管分泌物拭子、肺組織等樣本中的霍亂弧菌O1，用于霍亂弧菌O1感染

的輔助診斷，其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計一對霍亂弧菌O1特異性引物，結(jié)合一條特異

性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對霍亂弧菌O1的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)

診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是革蘭氏陰性菌，菌體短小呈逗點狀，有單鞭毛、菌毛，部分有莢膜。共分為139個血清群，其中O1群和O139群可引起霍亂。

霍亂弧菌是人類霍亂的病原體,霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。屬于國際檢疫傳染病。

弧菌屬(Vibrio)中霍亂弧菌(V.cholerae)、引起一種烈性腸道傳染病，發(fā)病急、傳染性強(qiáng)、病死率高，屬于國際檢疫傳染病。

霍亂弧菌包括兩個生物型:古典生物型(Classical biotype)和埃爾托生物型(EL-Tor bio-type)。這兩種型別除個別生物學(xué)性狀稍有不同外，形態(tài)和免疫學(xué)性基本相同，在臨床病理及流行病學(xué)特征上沒有本質(zhì)的差別。自1817年以來，全球共發(fā)生了七次世界性大流行，前六次病原是古典型霍亂弧菌，第七次病原是埃爾托型所致。PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎）建立的。這項技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價值。

PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對較簡單。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

【注意事項】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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