轉(zhuǎn)基因大米Bt（cryAc）熒光PCR試劑盒

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：轉(zhuǎn)基因大米Bt（cryAc）熒光PCR試劑盒

Name  ：Transgenic Rice Bt (CryAc) Gene Detection Kit (Real-Time PCRMethod)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米Bt（CryAc)基因，用于篩查待檢測(cè)植物中是否含有CryAc成分。其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒用國家標(biāo)準(zhǔn)的CryAc特異性引物和探針，用熒光PCR 技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。

【試劑組成】

說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃避光保存、運(yùn)輸、避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

稱取200g樣品。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過6個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0℃冰壺。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

固體樣本：用粉碎機(jī)或冷凍研磨儀將樣品研磨至細(xì)粉狀。

1.2 DNA提取

對(duì)于固體標(biāo)本，DNA的提取可以采用SN/T 2584-2010中推薦的方法：

1) 每個(gè)樣品取2個(gè)平行管。稱取200mg粉碎的樣品，加入1mL預(yù)冷至4℃的抽提液，劇烈搖動(dòng)混勻后，在冰上靜止5min，4℃條件下10000g離心15min，棄上清液；

2) 加入600uL預(yù)熱至65℃的裂解液，充分重懸沉淀，在65℃恒溫保持40min，期間顛倒混勻5次；

3) 室溫條件下10000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入5uLRNAseA，37℃恒溫30min，分別用等體積苯/酚：異戊醇溶液和三氯jia烷：異戊醇溶液各抽提一次；

4) 室溫條件下，10000g離心10min，取上清液至新離心管，加入三分之二體積的異丙醇，十分之一體積的3mol/L的乙酸鈉溶液（pH=6.5），-20℃放置2-3h；

5) 在4℃條件下，10000g離心15min，棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀；

6) 加入50uL TE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶解即為樣品DNA溶液。

也可使用等效的DNA/提取試劑盒。

油脂樣本請(qǐng)直接選用市售油脂DNA/提取試劑盒，按說明操作

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL，加入相應(yīng)的

反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25ul；熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測(cè)通道Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；
可疑：檢測(cè)通道35<Ct值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為35<Ct值≤38，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

6. 檢測(cè)方法的局限性

? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

? 陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38或無Ct值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且Ct值≤32；

以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

【注意事項(xiàng)】

? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

? 實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。