輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說明書

                                         微量法 100管/48樣

注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，NADP⁺和NADPH含量測定可以計算NADP（NADPH + NADP⁺ )含量和NADPH/NADP⁺比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP⁺比值不僅是細胞氧化還原態(tài)的主要標志之一，而且在PPP途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP⁺和NADPH。NADPH通過PMS的遞氫作用，使氧化型噻唑藍（MTT）還原為甲瓚，570nm下檢測吸光值，從而測定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP⁺為NADPH，從而檢測NADP⁺含量。

所需的儀器和用品：

酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

酸性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，-20 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻；溶解后4 ℃保存一周；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1支，4 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑五：液體3.6mL×1支，4 ℃保存；

試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。

NADP⁺和NADPH的提取：

1 血清（漿）中NADP⁺和NADPH的提取

NADP⁺的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADPH的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2組織中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADPH的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3 細胞或細菌中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADPH的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、   分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

混勻，取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下讀取對照吸光值A1和測定管吸光值A2，計算△A=A2-A1。

注意事項：

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。 

4、若NADP⁺測定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH測定中△A（A2-A1）≤0.0259，說明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：（1）將測定管避光靜置時間20min延長到60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取0.2g樣本或0.2mL樣本加入1mL提取液。

5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒100管保證測48個NADP⁺或NADPH.

NADP⁺和NADPH含量的計算：

（一）NADP⁺含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.0985x + 0.0144，R² = 0.9998；其中y為△A，x為NADP⁺濃度nmol/mL

1、血清（漿）中NADP⁺含量計算

NADP⁺含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144）

2、組織、細菌或細胞中NADP⁺含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADP⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADP⁺ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144）÷W

 (3)按細菌或細胞密度計算

NADP⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144）

（二）NADPH含量的計算

標準條件下的回歸曲線為y = 0.6198x + 0.0259，R² = 0.9977；其中y為△A，x為NADPH濃度nmol/mL

1、血清（漿）中NADPH含量計算

NADPH含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259）

2、組織、細菌或細胞中NADPH含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADPH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259）÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

注 意：Z低檢測限為0.01nmol/mL或0.01nmol/g鮮重 或0.001nmol/mg prot

輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒僅供科研！