馬立克氏病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：馬立克氏病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Marek’s Disease Virus(MDV) SYBR qPCR Kit

馬立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus，MDV)會(huì)引起馬立克氏病，是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)和增大，引起肢（翅）麻痹，以及性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚腫瘤病灶。本病是一種世界性疾病，目前是危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的三大主要疫病之一，引起雞群較高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)雞業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失，因此馬立克氏病病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的馬立克氏病病毒染料法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據(jù)馬立克氏病病毒保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。

3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。

4. 一管式熒光定量PCR檢測(cè)，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

【試劑組成】

【儲(chǔ)存條件及有效期】

低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

【自備試劑】DNA模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。

【使用方法】

一、稀釋PCR陽性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）

注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA

1.       片段作為陽性對(duì)照。

2.      標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3.      用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4.      在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

5.      換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

6.      換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

7.      重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8.       如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?span>10μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

       9.      用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA/提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10.       如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11.      在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對(duì)照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。

12.       蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí)，最大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時(shí)的最大吸收光譜在500 nm，最大發(fā)射光譜在530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14.       如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

       15.     如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。