γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                          微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

γ-GT是γ-谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨?；衔锷系?/span>γ-谷氨?；D(zhuǎn)移到受體。也可以催化GSH和其他γ-谷氨?；衔锏乃猓a(chǎn)生谷氨酸鹽，在細(xì)胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。

測(cè)定原理：

γ-GT催化谷氨酰對(duì)硝基苯胺中γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移給N-甘氨酰甘氨酸，生成對(duì)硝基苯胺，在405nm有特征光吸收；通過(guò)測(cè)定405nm光吸收增加速率，來(lái)計(jì)算γ-GT酶活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體14.8mL×1瓶，4℃保存。

工作液（在試劑二瓶中配制）：臨用前配制，把試劑三倒入試劑二瓶中，充分溶解（室溫過(guò)低時(shí)可以40℃水浴促進(jìn)溶解）；然后把試劑四倒入試劑二瓶中，混勻后室溫保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

γ-GT測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到405 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱30min（保證無(wú)沉淀）。

3. 測(cè)定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，180μL工作液，混勻后于405nm測(cè)定10s和70s時(shí)吸光度，記為A1和A2。

γ-GT活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.006x+0.0016，x為對(duì)硝基苯胺濃度，y為吸光值，R²=0.999。

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/10⁴ cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mL）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷V樣÷T

= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016]

V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4L；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），1min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.003x+0.0016，x為對(duì)硝基苯胺濃度，y為吸光值，R²=0.999。

 (1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=3.34× [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/10⁴ cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mL）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷V樣÷T

= 3.34 × [ (A2－A1)－0.0016]

V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×10^-4L；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量，g；V樣：反應(yīng)體系中加入上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），1min。

注意事項(xiàng)：

1.        培養(yǎng)細(xì)胞中γ-GT活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中γ-GT的提取時(shí)可加試劑一后

2.        研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞（防止因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性導(dǎo)致酶失活）。

3.        配置好的工作液2周內(nèi)使用完畢。