硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（TPX）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

                                                 微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

TPX屬于過(guò)氧化物酶家族，在體內(nèi)主要通過(guò)還原過(guò)氧化氫和一些氫過(guò)氧化物來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，功能與GPX類似，也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內(nèi)，如酵母、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、寄生蟲、細(xì)菌和古細(xì)菌，在進(jìn)化上高度保守。TPX與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關(guān)。TPX的主要功能包括細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過(guò)氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。

測(cè)定原理：

TPX催化H₂O₂氧化二硫蘇糖醇（DTT），H₂O₂的吸收波長(zhǎng)為240nm，通過(guò)測(cè)定240nm吸光度的下降速率，即可計(jì)算出TPX活性。

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、和蒸餾水

試劑組成和配制:

試劑一：液體120mL×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體20mL×1瓶，- 20℃保存。

試劑三：液體2mL×1支，4℃。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        血清等液體：直接測(cè)定。

TPX測(cè)定操作：

取微量石英比色皿或96孔板，加入4 μL上清液，180 μL試劑二，16 μL試劑三，迅速混勻后于240 nm測(cè)定10s和130s吸光度，記為A1和A2。

TPX活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

TPX（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=573×(A1－A2)÷Cpr

 (2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性（nmol/min/g 鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性（nmol/min/10⁴ cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=573×(A1－A2)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

=573×(A1－A2)

ε：H₂O₂的摩爾消光系數(shù)，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200 μ L=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），4 μL=4×10^-3 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=1146×(A1－A2)÷Cpr

 (2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性（nmol/min/g 鮮重）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1146×(A1－A2)÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性（nmol/min/10⁴ cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1146×(A1－A2)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol H₂O₂降解為1個(gè)酶活單位。

TPX活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T

=1146×(A1－A2)

ε：H₂O₂的摩爾消光系數(shù)，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200 μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），4 μ L=4×10^-3 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min。